作业帮构建RNAi载体用的I型启动子和其他启动子有什么区别?用II型不行么?
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/05/05 23:57:29
构建RNAi载体用的I型启动子和其他启动子有什么区别?用II型不行么?
构建RNAi载体用的I型启动子和其他启动子有什么区别?用II型不行么?
构建RNAi载体用的I型启动子和其他启动子有什么区别?用II型不行么?
多数的siRNA表达载体依赖RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种,操纵一段45—50nt的发夹结构RNA（small hairpin RNA,shRNA）在哺乳动物细胞中的表达,shRNA在细胞内会自动被加工成为siRNA,从而引发基因沉默或者表达抑制.这一类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子等.采用RNA pol III启动子的原因是由于它有明确的启始和终止序列,总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA,遇到4—5个连续的U即终止,并且转录产物在第二个尿嘧啶处被切下来,非常精确,而且还可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA.转录出的RNA形成发卡样结构后,会在3’端形成2个突出的尿嘧啶,这类似于天然的siRNA,因而有利于双链RNA诱发RNAi.要使用这类载体,需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火后克隆到相应载体的pol III 启动子下游.克隆的过程需要几天的时间,也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的.
先在体外构建能表达双链RNA的载体,再将载体转移到细胞内在细胞内合成出双链RNA,不但能增加有效转染细胞的种类,而且在长期稳定表达载体的细胞株中,双链RNA能够长期发挥阻断基因的作用.
现在有多个报道说通过质粒表达siRNAs同样可以抑制特定基因的表达.当这种带有PolIII 启动子和shRNA编码序列的质粒转染哺乳动物细胞时,这种能表达siRNA的质粒确实能够下调特定基因的表达,抑制范围包括外源基因和内源基因.
腺病毒是体内转基因的常用载体.Xia HaiBin等用腺病毒做载体,在体内和体外表达dsRNA,并成功的阻断了基因的表达,从而实现了成体动物的基因敲除.
最近多个厂家开始研究逆转录病毒和其他病毒载体用于siRNA表达,其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究,避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便.
主要优点：
1.是唯一可以进行长期研究的方法.双链RNA只能短暂抑制哺乳动物细胞的基因表达,而具有发卡结构的双链RNA能够增加阻断基因表达的时间.在小鼠畸胎瘤细胞,胚胎干细胞,C2C12细胞中,用长链具有发卡结构的双链RNA有效的阻断了报告基因的表达,在稳定表达具有发卡结构的双链RNA的细胞株中,报告基因的表达被长期的阻断了.带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久.即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选,也有助于富集带质粒的细胞.这也可以帮助解决一些难转染的细胞由于转染效率低造成的问题.
2.由于质粒可以复制扩增,相比起化学合成来说,能够显著降低制备siRNA的成本.
适用：已知一个有效的siRNA序列,需要维持较长时间的基因沉默,或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞.长期研究.
不适用：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）.